間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基的使用方法詳細說明

　　目前，血清仍是動物細胞培養(yǎng)中基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。

　　為了使細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細胞:

　　1.處于對數(shù)生長中期

　　2.>90% 活細胞率

　　3.適應(yīng)時以較高的起始細胞接種

　　細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法

　　1.直接適應(yīng)--細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中。

　　一些類型細胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng)，接種細胞密度應(yīng)該:2.5×10~3.5×10細胞/ml。當(dāng)細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml時，傳代培養(yǎng)細胞。當(dāng)細胞密度在培養(yǎng)4到7天后達到2×10~4×10細胞/ml時，細胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml，細胞活率在90%時，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

　　2.連續(xù)適應(yīng)--分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩毎訙睾鸵恍?/p>

　　(1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

　　(2)當(dāng)細胞密度>5×10細胞/ml時，以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

　　(3)以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

　　(4)當(dāng)細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml(接種后4到6天)，在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

　　(5)每隔3到5天，當(dāng)細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml，細胞活率在90%時，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

　　建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。

　　在適應(yīng)過程中，不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。